Identifikace enzymových aktivit štěpících sacharosu v kultuře bakterie Leuconostoc garlicum

Abstract

Dextransacharasa je enzym, původně izolovaný z bakterie Leuconostoc mesenteroides, který katalyzuje přenos zbytků D-glukopyranosylu ze sacharózy do struktury dextranu, přičemž se uvolňuje fruktosa. Dextran je látka hojně používaná v lékařství jako náhradní koloidní roztok krevní plasmy (plasmaexpander). Využívá se i jako sorbent k separaci molekul v náplňových kolonách (sephadex). Dextran tvořený bakterií leuconostoc garlicum vykazuje relativně vysoký stupeň čistoty a její roztoky vykazují relativně nízkou viskozitu. Existuje několik možných metod jak prokázat aktivitu enzymu s jeho následnou izolací. Některé tyto postupy jsou studovány v této práci. Enzymová aktivita štěpící sacharosu může být prokázána metodou na redukující cukry, která využívá kyseliny bicinchoninové. Metoda je založena na detekci měďných iontů vzniklých redukcí iontů měďnatých redukujícími sacharidy pomocí této kyseliny. S využitím této metody bylo možno stanovit Michaelisovu konstantu enzymu, Pro ověření identity enzymové reakce byla vyvinuta metoda na bázi chromatografie na tenké vrstvě. Ta slouží k rozlišení jednotlivých redukujících monosacharidů, a tedy k určení vedlejšího produktu enzymem katalyzované reakce. Zjištěná přítomnost fruktosy v reakční směsi potvrzuje, že aktivním enzymem je skutečně dextransacharasa. Zároveň byla zkoumána i možnost detekce enzymové aktivity metodou zymogramu, tedy identifikace dextranu vytvořeného aktivní dextransacharasou v gelu po gelové elektroforéze. Tato metoda však neposkytla očekávané výsledky, pravděpodobně proto, že dextransacharasa je z podstatné části vázána na dextran. Byly rovněž učiněny pokusy o izolaci a zakoncentrování dextransacharasy, bylo však dosaženo pouze dílčího úspěchu metodou frakčního vysolování proteinů síranem amonným.